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分子/免疫

1.实时荧光定量PCR(qPCR)

技术原理:实时荧光定量PCR是一种在DA扩增反应中,通过荧光信号对PCR过程进行实时监测,从而对起始模板进行定量分析的技术。其核心原理是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线或相对定量方法(如2 (-ΔΔCt))对未知模板进行精确计算。常用的化学方法有SYBR Gree法(与双链DA结合发光)和TaqMa探针法(序列特异性探针水解发光)。

实验流程:

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交付标准:

原始数据:提供qPCR仪导出的原始数据文件(如.eds, .qpc等)和扩增曲线、溶解曲线图。

实验报告:包含RA/DA质量检测结果(浓度、纯度A260/A280)、所用引物/探针序列、试剂盒品牌、PCR反应程序等。

定量结果:提供Ct值、标准曲线(绝对定量)或相对表达量(如2^(-ΔΔCt)值)的Excel表。

结果说明:对实验过程和结果进行简要的文字总结与分析。


2.蛋白质印迹(Wester Blot, WB)

技术原理:Wester Blot是一种用于检测特定蛋白质在复杂样本中表达情况、分子量及相对含量的技术。其原理是将蛋白质样本通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按分子量大小分离,然后转移到固相载体(如PVDF膜)上,再用特异性抗体与目标蛋白结合,最后通过化学发光或荧光等方法显色,从而对目标蛋白进行定性、半定量分析。

实验流程:

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交付标准:

原始图像:提供完整的、未裁剪的化学发光/荧光扫描图像文件。

实验报告:详细记录一抗、二抗信息、稀释比例、封闭条件、曝光时间等。

分析结果:提供经过裁剪的目标条带和内参条带图像,以及基于条带灰度值的半定量分析数据(通常以目标蛋白/内参蛋白的比值表示)。

分子量标记:图像上需标有分子量标记。


3.酶联免疫吸附测定(ELISA)

技术原理:ELISA是一种基于抗原抗体特异性反应和酶高效催化作用的高灵敏度检测技术。其基本原理是将抗原或抗体包被在固相载体上,使免疫反应在固相表面进行;然后通过洗涤去除游离成分;加入酶标记的抗体或抗原后,固相上的酶量与样本中待测物质的量相关;最后加入酶底物,根据显色深度进行定性或定量分析。

实验流程:

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交付标准:

原始数据:提供酶标仪导出的原始OD值数据表格。

实验报告:详细说明ELISA试剂盒品牌、货号、批号及实验流程。

标准曲线与计算结果:提供标准曲线图(R²值)和根据标准曲线计算出的各样本浓度值(如pg/mL或g/mL)。


4.免疫共沉淀(Co-Immuoprecipitatio, Co-IP)

技术原理:Co-IP是用于研究体内蛋白质相互作用的经典技术。其原理是:在非变性条件下裂解细胞,保持蛋白质-蛋白质间的天然相互作用;利用针对目标蛋白(诱饵蛋白)的特异性抗体与细胞裂解液孵育,形成“抗体-诱饵蛋白-互作蛋白”复合物;然后通过能与抗体Fc段结合的Protei A/G琼脂糖珠将该复合物沉淀下来;经过洗涤后,通过WB检测沉淀物中是否存在已知或未知的相互作用蛋白(猎物蛋白)。

实验流程:

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交付标准:

原始图像:提供Co-IP产物及Iput、IgG对照的WB检测原始图像。

实验报告:详细记录所用抗体、beads品牌、裂解液配方、洗涤条件等。

结果分析:对WB结果进行解读,明确显示在实验组中共同沉淀了互作蛋白,而阴性对照组没有。

关键对照:报告必须包含Iput(总蛋白对照)和IgG对照(非特异性抗体对照)的结果。


5.荧光素酶

技术原理:

该技术的核心原理是将目标基因的转录调控序列(如启动子、增强子或应答元件)克隆至一个携带荧光素酶基因的报告质粒中。然后将该重组质粒与内参质粒(通常为携带海肾荧光素酶或β-半乳糖苷酶基因的质粒)一同转染至活细胞中。

报告质粒:其表达的荧光素酶活性反映了目标启动子/调控元件的转录活性。

内参质粒:其表达活性用于校正转染效率、细胞数量和细胞活性的差异,使结果更可靠。

转染后,裂解细胞并加入底物。在荧光素酶的作用下,底物荧光素被氧化并发出生物荧光。通过化学发光检测仪读取相对光单位,最终用报告质粒的荧光素酶活性值 / 内参质粒的荧光素酶活性值 的比值来精确反映目标序列的调控活性。

实验流程:

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交付标准:

原始数据:提供化学发光检测仪导出的原始RLU数据表格。

标准化结果:提供经过内参校正后的标准化荧光素酶活性比值(Firefly/Reilla或实验组/对照组)的Excel表格。

统计图表:提供清晰的柱状图,展示不同实验组间的相对荧光素酶活性,并标注统计学差异(如*p < 0.05, **p < 0.01)。

实验报告:包含详细的实验方法,如细胞系、质粒构建信息、转染方法、试剂品牌、检测系统等。


6.生化检测

技术原理:生化检测是一个广义概念,指利用生物化学方法对样本中的特定物质(如代谢物、酶、离子等)进行定性和定量分析。其原理多种多样,包括但不限于:

比色法:待测物与特定试剂反应生成有色物质,其颜色深度与浓度成正比。

酶学法:利用酶的特异性催化反应,通过监测底物消耗或产物生成速率来计算酶活力或底物浓度。

化学发光法:待测物参与反应并产生光信号,通过检测光强度进行定量。

实验流程:

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交付标准:

原始数据:提供仪器导出的原始吸光度/发光值等数据。

实验报告:明确说明所使用的检测方法(如试剂盒名称、货号、方法学原理)。

计算结果:提供所有样本的最终浓度、活性或含量计算结果(如mmol/L, U/mg prot等)。



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