基础实验平台

3.5.1病理/组化

病理平台可承接：石蜡切片，切片扫描，荧光扫描，HE染色，各种特殊染色，如：Masso、油红O、Masso、番红O、PAS、甲苯胺蓝、ALP以及免疫组化/荧光、原位杂交等。

组织石蜡切片和冰冻切片：

石蜡切片是病理学研究中经典、应用最广泛的制片技术。该技术通过一系列精细的处理步骤，将组织包埋在石蜡中，通过“石蜡”这种支撑介质，替换出组织内的水分，将柔软的生物组织变成坚硬的“蜡块”，从而能够利用精密的切片机进行超薄切片，为微观观察提供可能。石蜡切片能提供极佳的组织形态结构和清晰的细胞细节，是进行长期回顾性研究和多种分子检测的理想选择。

冰冻切片是一种快速制片技术，它通过将新鲜或固定后的组织在低温下快速冷冻，使组织变硬，然后直接进行切片。该技术最大限度地保留了组织的生物活性，是许多对温度敏感的生物大分子（如某些抗原、酶活性）检测的首选方法。

苏木精-伊红（HE）染色

技术原理：苏木精-伊红染色即HE染色，是形态学研究常用的染色方法。苏木精（Hematoxyli）是碱性染料，能够将细胞核内的核酸（DA/RA）和核糖体染成蓝紫色。伊红（Eosi）是酸性染料，能够将细胞质和胞外基质中的蛋白质等染成粉红色。通过颜色对比，可以清晰地展示组织的形态结构，用于观察细胞排列、病理变化（如炎症、坏死、肿瘤等）

实验流程：

交付标准：

原始数据：所有扫描图像的原始电子文件。

实验报告：包含实验方法、仪器型号、试剂品牌等信息的标准化报。

结果说明：对染色结果进行简要描述（如组织形态是否完整、细胞核与细胞质染色对比是否清晰等）。

图像格式：提供全片扫描（WSI）和/或不同倍数（如40x， 100x， 200x， 400x）的典型区域图像

免疫组化（IHC）

技术原理：利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如DAB）显色，从而对组织或细胞中的特定抗原（通常是蛋白质）进行定位、定性和相对定量研究。最终在光学显微镜下可观察到棕黄色或棕褐色的阳性信号。

实验流程：

交付标准：

原始数据：所有扫描图像的原始电子文件。

实验报告：详细记录一抗信息（克隆号、种属、稀释比例）、抗原修复方法、二抗及检测系统、显色条件等。

阴性/阳性对照：提供对照实验结果，确保实验特异性。

免疫荧光

技术原理：与IHC原理相似，也是基于抗原抗体特异性结合。但标记二抗的不是酶，而是荧光素（如FITC， TRITC, Cy3, Cy5, Alexa Fluor系列）。在特定波长激光的激发下，荧光素会发出特定颜色的荧光，从而在荧光显微镜下对目标蛋白进行定位和观察。也可实现多重标记（同一张切片检测2种或以上蛋白）。

实验流程：

交付标准：

原始数据：各通道（Chael）的原始图像文件（如.tiff格式），以及合并后的彩色图像。

实验报告：详细记录所用一抗、二抗（荧光素种类）、图像采集参数（曝光时间、激光强度等）。

结果展示：提供单通道灰度图、合并图（标注不同颜色代表的蛋白）和DAPI核染图。

特殊染色

TUEL检测

技术原理：TUEL（TdT-mediated dUTP ick-Ed Labelig）是一种用于检测细胞凋亡过程中DA断裂的技术。其原理是利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记的dUTP（通常为荧光素或生物素）连接到断裂DA的3’-羟基末端，从而在凋亡细胞核中产生特异性信号。由于坏死细胞也有DA断裂，需结合形态学加以区分。

实验流程：

交付标准：

原始数据：荧光或明场扫描图像。

实验报告：详细记录实验方法、试剂盒品牌及批次。

阳性/阴性对照：提供对照实验结果。

荧光原位杂交（FISH）

技术原理：FISH利用荧光标记的核酸探针，依据碱基互补配对原则，与细胞或组织切片中的特定DA或RA序列进行杂交，从而在荧光显微镜下对目标基因或转录本进行定位、定性和定量分析。常用于基因扩增（如HER2）、基因易位（如ALK）、基因缺失及染色体数目异常等研究。

实验流程：

交付标准：

原始数据：各通道（探针通道、DAPI通道）的原始图像及合并图像。

实验报告：详细记录所用探针信息（基因位点、品牌）、杂交条件、图像采集参数。

结果分析：提供典型细胞图像，并根据信号计数规则进行判读，给出明确的诊断或分析结论（如扩增、非扩增；易位、未易位）。

信号计数图：可提供带有信号计数的分析图。

3.5.2 分子/免疫

实时荧光定量PCR（qPCR）

技术原理：实时荧光定量PCR是一种在DA扩增反应中，通过荧光信号对PCR过程进行实时监测，从而对起始模板进行定量分析的技术。其核心原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线或相对定量方法（如2 (-ΔΔCt)）对未知模板进行精确计算。常用的化学方法有SYBR Gree法（与双链DA结合发光）和TaqMa探针法（序列特异性探针水解发光）。

实验流程：

交付标准：

原始数据：提供qPCR仪导出的原始数据文件（如.eds, .qpc等）和扩增曲线、溶解曲线图。

实验报告：包含RA/DA质量检测结果（浓度、纯度A260/A280）、所用引物/探针序列、试剂盒品牌、PCR反应程序等。

定量结果：提供Ct值、标准曲线（绝对定量）或相对表达量（如2^(-ΔΔCt)值）的Excel表。

结果说明：对实验过程和结果进行简要的文字总结与分析。

蛋白质印迹（Wester Blot, WB）

技术原理：Wester Blot是一种用于检测特定蛋白质在复杂样本中表达情况、分子量及相对含量的技术。其原理是将蛋白质样本通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）按分子量大小分离，然后转移到固相载体（如PVDF膜）上，再用特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过化学发光或荧光等方法显色，从而对目标蛋白进行定性、半定量分析。

实验流程：

交付标准：

原始图像：提供完整的、未裁剪的化学发光/荧光扫描图像文件。

实验报告：详细记录一抗、二抗信息、稀释比例、封闭条件、曝光时间等。

分析结果：提供经过裁剪的目标条带和内参条带图像，以及基于条带灰度值的半定量分析数据（通常以目标蛋白/内参蛋白的比值表示）。

分子量标记：图像上需标有分子量标记。

酶联免疫吸附测定（ELISA）

技术原理：ELISA是一种基于抗原抗体特异性反应和酶高效催化作用的高灵敏度检测技术。其基本原理是将抗原或抗体包被在固相载体上，使免疫反应在固相表面进行；然后通过洗涤去除游离成分；加入酶标记的抗体或抗原后，固相上的酶量与样本中待测物质的量相关；最后加入酶底物，根据显色深度进行定性或定量分析。

实验流程：

交付标准：

原始数据：提供酶标仪导出的原始OD值数据表格。

实验报告：详细说明ELISA试剂盒品牌、货号、批号及实验流程。

标准曲线与计算结果：提供标准曲线图（R²值）和根据标准曲线计算出的各样本浓度值（如pg/mL或g/mL）。

免疫共沉淀（Co-Immuoprecipitatio, Co-IP）

技术原理：Co-IP是用于研究体内蛋白质相互作用的经典技术。其原理是：在非变性条件下裂解细胞，保持蛋白质-蛋白质间的天然相互作用；利用针对目标蛋白（诱饵蛋白）的特异性抗体与细胞裂解液孵育，形成“抗体-诱饵蛋白-互作蛋白”复合物；然后通过能与抗体Fc段结合的Protei A/G琼脂糖珠将该复合物沉淀下来；经过洗涤后，通过WB检测沉淀物中是否存在已知或未知的相互作用蛋白（猎物蛋白）。

实验流程：

交付标准：

原始图像：提供Co-IP产物及Iput、IgG对照的WB检测原始图像。

实验报告：详细记录所用抗体、beads品牌、裂解液配方、洗涤条件等。

结果分析：对WB结果进行解读，明确显示在实验组中共同沉淀了互作蛋白，而阴性对照组没有。

关键对照：报告必须包含Iput（总蛋白对照）和IgG对照（非特异性抗体对照）的结果。

荧光素酶

技术原理：

该技术的核心原理是将目标基因的转录调控序列（如启动子、增强子或应答元件）克隆至一个携带荧光素酶基因的报告质粒中。然后将该重组质粒与内参质粒（通常为携带海肾荧光素酶或β-半乳糖苷酶基因的质粒）一同转染至活细胞中。

报告质粒：其表达的荧光素酶活性反映了目标启动子/调控元件的转录活性。

内参质粒：其表达活性用于校正转染效率、细胞数量和细胞活性的差异，使结果更可靠。

转染后，裂解细胞并加入底物。在荧光素酶的作用下，底物荧光素被氧化并发出生物荧光。通过化学发光检测仪读取相对光单位，最终用报告质粒的荧光素酶活性值 / 内参质粒的荧光素酶活性值 的比值来精确反映目标序列的调控活性。

实验流程：

交付标准：

原始数据：提供化学发光检测仪导出的原始RLU数据表格。

标准化结果：提供经过内参校正后的标准化荧光素酶活性比值（Firefly/Reilla或实验组/对照组）的Excel表格。

统计图表：提供清晰的柱状图，展示不同实验组间的相对荧光素酶活性，并标注统计学差异（如*p < 0.05, **p < 0.01）。

实验报告：包含详细的实验方法，如细胞系、质粒构建信息、转染方法、试剂品牌、检测系统等。

生化检测

技术原理：生化检测是一个广义概念，指利用生物化学方法对样本中的特定物质（如代谢物、酶、离子等）进行定性和定量分析。其原理多种多样，包括但不限于：

比色法：待测物与特定试剂反应生成有色物质，其颜色深度与浓度成正比。

酶学法：利用酶的特异性催化反应，通过监测底物消耗或产物生成速率来计算酶活力或底物浓度。

化学发光法：待测物参与反应并产生光信号，通过检测光强度进行定量。

实验流程：

交付标准：

原始数据：提供仪器导出的原始吸光度/发光值等数据。

实验报告：明确说明所使用的检测方法（如试剂盒名称、货号、方法学原理）。

计算结果：提供所有样本的最终浓度、活性或含量计算结果（如mmol/L, U/mg prot等）。

3.5.3 细胞生物学

流式检测

技术原理：流式细胞术是一种对悬浮细胞进行快速、多参数定量分析和分选的技术。其原理是：使单细胞悬液在鞘液的包裹下，高速通过激光检测区；细胞上的荧光染料或荧光标记抗体被激光激发，产生散射光和荧光信号；这些信号被探测器接收并转化为电信号，经计算机处理后可分析细胞的大小、粒度、表型、细胞周期、凋亡率等。

实验流程：

交付标准：

原始数据：提供流式细胞仪导出的.FCS格式原始数据文件。

实验报告：包含样本信息、所用抗体/染料详情、仪器型号、分析方案（Gatig Strategy）。

分析结果：提供统计结果（如阳性细胞百分比、平均荧光强度、细胞周期各时相比例等）及分析图（散点图、直方图）。

细胞增殖（CCK8、MTT）

技术原理：

CCK-8：试剂中含有水溶性的四唑盐WST-8，它在细胞线粒体脱氢酶的作用下被还原为橙黄色的甲臜产物，该产物溶于培养基，颜色深度与活细胞数量成正比。

MTT：试剂中的四唑盐MTT被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为不溶于水的蓝紫色甲臜结晶，结晶经DMSO溶解后，通过检测吸光度来反映细胞数量。

实验流程：

交付标准

原始数据：提供酶标仪导出的各孔OD值原始数据。

实验报告：包含细胞系、接种密度、试剂品牌、孵育时间等详细信息。

分析图表：提供细胞活力曲线（折线图或柱状图），并计算IC50等关键参数（如适用）。

细胞凋亡

技术原理：

常用Aexi V-FITC/PI双染法。其原理基于：

Aexi V-FITC：与早期凋亡细胞外翻的磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。

碘化丙啶（PI）：一种核酸染料，不能透过完整细胞膜，但可穿过晚期凋亡和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。

通过流式细胞术可区分活细胞（Aexi V-/PI-）、早期凋亡细胞（Aexi V+/PI-）、晚期凋亡细胞（Aexi V+/PI+）和坏死细胞（Aexi V-/PI+）。

实验流程：

交付标准

原始数据：提供.FCS格式原始数据文件。

实验报告：详细记录实验步骤、试剂盒品牌。

分析结果：提供流式细胞术散点图，以及各象限（Q1-Q4）细胞百分比的统计分析表格和图表。

细胞迁移（traswell、划痕）

技术原理：

Traswell迁移：利用一种称为Traswell小室的装置，其内部有一张带有微孔（通常直径为8μm）的聚碳酸酯膜。将细胞接种于上室，下室中加入含有趋化因子（如胎牛血清FBS或特定细胞因子）的培养基。细胞在趋化因子的诱导下，会主动迁移穿过微孔，到达下室底面。通过对迁移至下室底面的细胞进行染色和计数，即可定量评估细胞的迁移能力。

细胞划痕：也称为伤口愈合。在培养板中培养的细胞形成致密单层后，用无菌枪头或划痕器在细胞层上制造一道无细胞的“划痕”。然后继续培养，并通过显微镜定期观察和拍照，记录细胞向划痕区域迁移、直至“愈合”的过程。通过测量划痕面积随时间的变化，可以定量分析细胞的横向迁移能力。

实验流程：

Traswell迁移实验流程：

细胞划痕实验流程：

交付标准：

原始图像：提供Traswell下室膜的显微镜照片（多个随机视野）或划痕实验各时间点的显微镜照片。

实验报告：包含详细的实验方法，如细胞种类、接种密度、培养时间、趋化因子种类（Traswell）等。

定量结果：Traswell：提供每个视野的迁移细胞计数，以及不同实验组间的统计分析图表（柱状图）。细胞划痕：提供各时间点的划痕面积或愈合率数据，以及迁移曲线和统计分析。

细胞侵袭

技术原理：

细胞侵袭是细胞迁移的一种特殊形式，特指细胞穿过细胞外基质（ECM）或基底膜的能力，这在肿瘤转移过程中至关重要。该实验在Traswell迁移的基础上进行改进：在Traswell上室的微孔膜上预先铺覆一层基质胶（Matrigel），这是一种从Egelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的基底膜基质，能模拟体内的细胞外基质屏障。只有那些能够分泌蛋白酶（如基质金属蛋白酶MMPs）来降解基质胶，并同时具有运动能力的细胞，才能穿过这层屏障进入下室。因此，计数下室的细胞反映的是细胞的侵袭能力。

实验流程：

交付标准：

原始图像：提供Traswell下室膜的显微镜照片（多个随机视野），清晰显示已侵袭的细胞。

实验报告：详细记录实验方法，包括基质胶的型号、铺胶浓度与体积、细胞接种量、培养时间等。

定量结果：提供每个视野的侵袭细胞计数，以及不同实验组间的统计分析图表（柱状图）。通常会将侵袭实验结果与迁移结果结合分析，全面评估细胞的转移潜能。

血管形成

技术原理：

在体外模拟体内血管生成的过程。将基质胶铺在孔板中，使其在37℃下聚合形成类似体内基底膜的结构。然后将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）等接种于基质胶上，内皮细胞会迁移、分化、连接，并形成管状网络结构。通过计数网络节点、网格数等参数来评价化合物的促血管生成或抑制血管生成活性。

实验流程：

交付标准

原始图像：提供不同视野下管状结构的典型显微镜照片。

实验报告：记录所用细胞、基质胶品牌、细胞接种量、培养时间等。

分析结果：提供管状网络的分析数据，如节点数、网格数、总管状长度等，并附上统计分析。

克隆形成

技术原理：

评估单个细胞增殖能力和群体依赖性的金标准。将少量细胞接种于培养皿中，培养一段时间（1-3周），期间单个细胞会持续分裂形成一个肉眼可见的细胞集落（通常>50个细胞）。通过染色并计数集落数量，可以反映细胞的存活率、增殖能力和对药物/处理的敏感性。

实验流程：

交付标准：

原始图像：提供整个培养皿的克隆扫描图像或典型区域照片。

实验报告：记录细胞系、接种数量、培养时间、处理信息等。

定量结果：提供克隆计数、克隆形成率（克隆数/接种细胞数×100%）及统计分析图表。

细胞焦亡

技术原理：

细胞焦亡是一种Gasdermi家族蛋白介导的程序性细胞坏死，与炎症密切相关。检测方法多样，包括：

形态学观察：细胞胀大、膜破裂、形成气泡状凸起。

Wester Blot：检测焦亡关键蛋白（如GSDMD, GSDME）的剪切活化。

ELISA：检测上清中释放的炎症因子（如IL-1β, IL-18）。

荧光染色：使用针对GSDMD-端的抗体进行免疫荧光染色，或使用PI染料标记膜破裂的细胞。

实验流程：

交付标准：

原始数据：根据所选方法，提供WB原始图、ELISA数据、荧光图像等。

实验报告：详细记录所用方法、抗体、试剂盒信息。

综合分析报告：结合多种检测方法的结果，对细胞是否发生焦亡及其程度进行专业判读。

EDU细胞增殖

技术原理：

EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，在DA复制期可掺入新合成的DA中。EdU的乙炔基能与带有荧光染料的叠氮化物在铜催化下发生高效的“点击化学反应”，从而通过荧光显微镜或流式细胞术直接检测到正在进行DA合成的增殖细胞。与传统BrdU检测相比，无需DA变性，步骤更简便。

实验流程：

交付标准：

原始图像/数据：提供荧光显微镜照片或流式细胞术的.FCS文件。

实验报告：包含EdU孵育时间、点击化学试剂品牌、检测仪器等。

定量结果：提供EdU阳性细胞率（增殖指数）的统计分析图表。